血细胞分析仪的介绍 江苏省中医院 葛亮 血细胞分析仪50年的发展历史 1590 年荷兰人米德尔堡和詹森设计制造了最原始的显微镜（图1），1610 年伽利略使用望远镜观察小的物体并将其放大，后来被列文霍克改进成为原始的显微镜。1658 年意大利人马尔皮基应用最原始的显微镜首先观察到了红细胞，他是第一个见到红细胞的人，开始做红细胞计数则是200 年后的事情了。而设计并生产出第一台血细胞计数仪则又过了近100 年。 库尔特原理 计数原理是根据血细胞的不良导电性和产生电阻抗原理来计数血液中的细胞，也就是电阻式血细胞计数原理，这种原理现在慢慢的变成了血细胞计数和分析中最为经典的原理。 血细胞分析仪的技术进步 1、稀释技术的进步 2、分析参数的增加 3、血小板计数功能的增加 4、自动取样技术 5、仪器的清洗技术 6、小孔管技术的改进 其他计数原理的血细胞分析仪 1. 激光法：应用单束激光照射到经过鞘流技术处理的排列成一列的单个细胞上，根据细胞阻断激光束的频率以及PMT 收集到的激光折射信号，对细胞的数量、体积做多元化的分析的仪器。 其他计数原理的血细胞分析仪 2. 离心式血液分析仪：将血液充入到含义特殊试剂的毛细管内，在专用离心机上离心，根据血细胞中各种成份的比重不同而分布在不同的细胞层内的原理，血细胞被吖啶橙染色，各细胞层会有明显的颜色差异，然后将毛细管放在特殊的判读机上对不同的细胞层进行定量分析. 3. 移动光学法：早期的光学法血细胞计数仪器， 采用普通光源，血细胞在移动过程中被检测到，不能分析细胞的大小和内部结结构，因此仅可进行红细胞和白细胞的计数 从三分群到五分类 三分群： 小细胞 单个核细胞 粒细胞 五分类： 淋巴细胞 单核细胞 中性粒细胞 嗜酸细胞 嗜碱细胞 白细胞三分群法原理 各种单纯电阻法血细胞分析仪的白细胞三分群法原理是根据白细胞体积分布直方图做多元化的分析和计算得到的。经过特殊溶血剂处理的白细胞，可将特定的细胞群做处理，使得绝大多数淋巴细胞体积缩小，使得中性粒细胞体积适当增大。因此在白细胞分布直方图上出现两个明显的细胞分布峰。左侧体积较小的一群细胞称为淋巴细胞群（LYM），右侧体积较大的称为粒细胞群（GRAN），位于两者之间的称为中间细胞群（MID）， 中间细胞群一般指含有嗜酸粒细胞，嗜碱粒细胞和单核细胞的细胞群。 白细胞五分类法原理 进入90年代中期以来，国外许多厂家已经不满足于三分类型的血细胞分析仪，逐步开始研制和推出具有五分类或更多项白细胞分析技术的全自动型血液分析仪器，比较著名的厂家有：Coulter 、Sysmex 、ABBOTT 、Bayer 、ABX等。各厂家使用的白细胞分类技术多样化， 复杂化，使得白细胞分类技术更成熟和可靠。而技术的提高也带来了仪器和消耗品（试剂）价格的增加。 五分类VCS技术 运用V、C、S三种探针,在流式通道的某一位点,对通过的单列白细胞，进行逐个的、同时的、三重的检测，以及三维分析,以确定其亚群性质。 V-低频波，分析细胞体积； C-高频波，分析细胞核型； S-激光，分析细胞的颗粒特性。 接近原态的WBC分析 VCS检测 十余种异常细胞的报警提示 细胞化学技术：核酸荧光染色 区别于酸碱染色、酶染色、糖原染色 核酸染色物质（荧光物质） Polymethine （聚次甲基） Oxazine (口恶嗪） 不同的细胞亚群、不同的成熟阶段，其核酸的含量，核酸的结构，DNA/RNA的比例不同，表现不同的着色性。 和半导体激光有很好的适配性，633nm激发荧光 流式通道和光路系统 核酸染色和信号分析 采用阻抗、激光散射和荧光染色技术 直流电阻抗法（DC）用于测量细胞体积大小。激光散射产生的前向散射光、侧向散射光和侧向荧光可用于探测测白细胞体积大小、细胞内含物的情况( 细胞核以及颗粒情况)，侧向荧光则可以反应细胞内托样核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA ）的含量，特有的嗜酸性粒细胞检测溶血剂Strmatolyzer-EO 可将除了嗜酸细胞以外的所有细胞溶解或萎缩，含有完整嗜酸细胞的液体通过小孔可根据电阻法计数技术进行计数。在嗜碱细胞通道中，使用特殊溶血剂Strmatolyzer-BA 可将除了嗜碱细胞以外的所有细胞溶解或萎缩，含有完整嗜碱细胞的液体通过小孔可根据电阻法计数技术进行计数。 WBC分类散点图上的报警区域 网织红细胞散点图 IRF：未成熟网织红细胞比率 有效监控红细胞生成动力学 骨髓抑制 红细胞生成恢复期 血疗效的观察 ABX Pentra 系列五分类血细胞分析仪 ABX Pentra 系列全自动五分类血细胞分析仪，采用了白细胞计数通道，双鞘流检测通道(LMNE 散点图)和白细胞/嗜碱细胞（WBC/BAOS）通道一起进行检测来完成白细胞五分类的全面分析。LMNE 检测通道采用三种技术原理一起进行白细胞的分类：1、双鞘流原理（DHSS）2、细胞化学染色（Cytochemistry）结合吸光法原理3、鞘流阻抗技术（Focused Flow Impendance）。白细胞/嗜碱细胞检测通道：采用生物溶解技术，阻抗技术，域值界标技术进行白细胞计数及嗜碱细胞的检测。 ABX Pentra 系列 ABX 采用了先进的DHSS 专利检测技术，在分析五分类的同时能够检测两群异常白细胞亚群：①巨大未成熟细胞（LIC）百分比及绝对值 ②异型淋巴细胞（ALY）百分比及绝对值。 ABX 先进的白细胞分类原理能够很好的满足临床对异常细胞群的较高检测灵敏度，可提供82 种不同的报警信息及提示信息，形成了一套非常完整的白细胞分类的报警系统。 其它白细胞分类的原理 1.激光散射和细胞化学染色技术 ：仪器在白细胞分类上采用了白细胞过氧化酶测定通道和嗜碱粒细胞测定通道。根据细胞化学染色的特性进行白细胞分类。早期的原始粒细胞为阴性，原始粒细胞以下各阶段都含有过氧化物酶，并随着细胞的成熟而增强。不同的粒细胞过氧化物酶含量不同，嗜酸性粒细胞具有最强的过氧化物酶，中性粒细胞含有较强的过氧化物酶，嗜碱粒细胞不含此酶。单核细胞除早期原始阶段外，均含有较弱的过氧化物酶。淋巴细胞不含过氧化物酶。根据激光法散射光强度进行的细胞体积的测量同时也获得了细胞大小的信息，在白细胞过氧化物酶散点图上，X 轴表现过氧化物酶强度，过氧化物酶强阳性细胞位于右端；Y 轴表现散射光强度信号，位于上方的表示散射光信号强，细胞体积大。除了嗜碱细胞外每个类型的细胞根据它们的特点被记录于特定的位置，在设定的门的范围内形成分类 。 其它白细胞分类的原理 2.多角度偏振光散射法应用于白细胞五分类（MAPSS 技术）： 该技术的基础原理是标本在水动力聚焦系统的作用下进入检测部，在激光束的照射下，细胞在多个角度都产生散射光。仪器特别设置了四个角度来收集散射光的信号。0 度为前角光散射， 用于粗略判断细胞体积大小；10 度为狭角散射， 用于检测细胞结构及其内部复杂性的指标；90 度为垂直光散射，用于对细胞内部颗粒及细胞核分叶情况的分析；90 度偏振光散射，基于颗粒可以将垂直角度的激光消偏振的特性，将嗜酸性细胞从中性粒细胞和其他细胞中分离出来。根据散射光的角度和位置，仪器内部的四个检测器可以接收到相应的信号，由仪器内部的微处理器做多元化的分析处理，不同的细胞将被安置在散点图上的相应位置，根据计算将结果白细胞分类结果得到 血细胞分析仪的发展近况和展望 1、血常规检验多参数化 2、多功能合成扩展 3、检测速度的提高 4、方法的改进和进展 5、应用的方便性 结束语 目前血细胞分析仪越来越普遍的应用于各级医院的常规作中，但是并不是说所有的结果都是准确无误的，目前在血细胞形态学方面，无论是五分类还是更多的分类，甚至是具有专门幼稚细胞分析通道的仪器，仍然不能根本解决血液细胞形态学的问题，仍然不能完全以仪器分类结果彻底取代人工分类。此外仪器一些固有的产生误差的因素还没有完全解决，某些影响仪器计数准确性的个别因素还存在，或某些仪器具有设计上的缺陷和应用上的局限性，因此无论是细胞计数还是多种参数的分析结果仍然会有问题发生。不要总是相信仪器，要认认真真地对待每个实验样品和结果，分析判断这个结果，检验工作者要对仪器的性能，质量控制，局限性，常出现的故障，特别对直方图和五分类的散点图有深刻的了解，善于察觉缺陷和解决实际问题。这一切都有待于通过人们在熟练掌握仪器的性能和逐步的提升的自己的知识水平上，通过扎实的的显微镜下对血细胞形态学认知的基本功来处理问题。 * * * * 自从发明了显微镜以后，人们从微观世界中了解和观察到了血液的组成，并根据他们的特点分别将它们称为红细胞和白细胞和血小板。在以后的研究中，人们发现许多疾病的发生和发展与血液中的细胞数量之间有一定的关系。依据对疾病诊断的需求，人们开始寻求对血液中细胞的数量进行计数。1852 年就有人开始设计对红细胞的计数办法，1855 年发明了用于计数血细胞的计数板， 目前仍然使用的改良Neubauer 计数板就是应用最为广泛和维持的时间最为长久的经典一种，虽然很多类型的血细胞计数仪已在普遍的使用，但血细胞计数板法仍然是最为可靠和最为经典的计数技术，它不仅适用于血细胞计数， 还可用于其他细胞、动物血细胞、微小粒子及需要在显微镜下计数的各种样品，因此计数板仍然是检验工作者应该掌握的基本技能，是不应该忘记和放弃的手段。 最初的血细胞计数仪是一种单参数测定仪器，只能对血液中的红细胞和白细胞进行计数，并且需人工切换。最早生产的血球计数仪为Coulter 型 1958 年以Coulter 命名的专门从事颗粒性测量计数的仪器公司，库尔特电子（Coulterlectronics ）公司成立。 此后，欧洲、日本也开始了血液细胞计数仪的开发和研制,我国在60年代中期也开始了这种仪器的开发和生产。例如日本Sysmex 公司1962 年就生产了可进行红细胞和白细胞计数的CC-1001 型血球计数仪，我国1965年在上海也生产了简单的血细胞计数仪，1975 年北京医疗仪器厂也开始模仿设计自己的简单的红白细胞计数仪。到目前为止已经有许多国家开始生产很多类型的血细胞分析仪，经过半个多世纪的发展，这种仪器已经有了很明显的进步。以前因为只能进行细胞计数，因此我们一般将这类仪器叫做血细胞计数仪（Blood Cell Counter）,由于技术的进步目前这类仪器能够给大家提供除了血细胞计数以外的更多参数的联合测定和分析，因此我们一般将这类仪器统称为血液细胞分析仪(Hematology Analyzer) 。 Lymphocyte Monocyte Granulocyte 小细胞 单个核细胞 粒细胞 淋巴 嗜碱 单核 嗜酸 中性粒细胞 接近原态的白细胞 进入流式通道 八千多个白细胞逐个、直接、同时地在流式通道内接受VCS三重检测，得到各自的三维座标值 V C S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 半导体激光器 (?=633nm) 双色分光镜 光电倍增管 （荧光信号） 流动室 光电倍增管 （侧向散射光信号） 光电二极管 （前向散射光信号） 激光束 (?=633nm) 侧向荧光： DNA/RNA信息 侧向散射光： 细胞内结构信息 前向散射光： 细胞体积信息 Fluorescence Side Scatter Blasts/ Atypical Lymph Immature Gran Mono Lymph EO Left Shift Neut NRBC 体积 荧光 *

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